U pokusima PCR (lančana reakcija polimeraze), pakiranje se može činiti jednostavnim, ali izravno utječe na stabilnost reagensa, jednostavnost uporabe i pouzdane rezultate. Bez obzira na to je li skladištenje i transport laboratorija - pripremljen reagensi ili komercijalni premiksi, savladavanje odgovarajućih tehnika PCR pakiranja može izbjeći uobičajene pogreške i poboljšati eksperimentalnu učinkovitost. U nastavku dijelimo praktične savjete o odabiru materijala, strategijama pakiranja i detaljima pohrane.
I. Odabir materijala za pakiranje: prioritet kompatibilnosti i zaštitnosti
PCR reakcije su osjetljive na temperaturu, svjetlost i onečišćenja, tako da materijali za pakiranje moraju ispunjavati tri ključna zahtjeva: nepropusnost, svjetlost - dokazivanje i kemijsku inertnost.
Za epruvete za centrifugu i PCR ploče, poželjna je polipropilen (PP), zbog njegove visoke prozirnosti i DNaze/RNase - slobodnih svojstava . 0.2 ml tanke - zidne cijevi. Za 96 - bušotine PCR ploče preporučujemo odabir suknjenog dizajna (radi lakoće robotske manipulacije) ili ne-kriknog dizajna (za očuvanje prostora).
Metoda brtvljenja: Konvencionalne epruvete za centrifugu koriste ravne ili podignute kapice (kako bi se spriječilo isparavanje i sušenje). Međutim, za dugo - termin pohranjivanje, toplina - brtveni film (poput parafilma) ili prozračni film (kao što je Aeraseal) preporučuje se uravnoteženje unutarnjeg i vanjskog tlaka. PCR pločice se preporučuju za upotrebu ljepljivih aluminijskih folija (visoki - otporna na temperaturu) ili self - ljepljivi film (za pojedinačni - koristi).
Zaštita svjetlosti: Reagensi koji sadrže svjetlost - osjetljivi sastojci (poput određenih boja ili primera) trebaju biti zamotani u aluminijsku foliju, ili treba koristiti crne PCR ploče (dostupne od nekih proizvođača).
Ii. Tehnike alikvotiranja: Minimiziranje gubitaka od ponovljenih zamrzavanja - Cycles odmrzavanje
Alikvotiranje reagensa je temeljni korak u PCR pakiranju i izravno utječe na eksperimentalnu obnovljivost.
Alikvotiranje glavnog miksa: Komercijalne glavne mješavine (kao što su taq enzim i DNTP miks) preporučuju se alikvotirani na temelju volumena reakcije plus 5% - 10% marža (npr. Za reakciju od 20 μl, alikvot 22 μl po cijevi). Izbjegavajte korištenje izravno iz skupne pakiranja, jer opetovani zamrzavanje {- ciklusi odmrzavanja mogu dovesti do smanjene aktivnosti enzima (TAQ enzim može izgubiti otprilike 5% aktivnosti po ciklusu smrzavanja-odmrzavanja).
Primeri i predlošci: Primeri (posebno prilagođeni primeri) preporučuju se alikvotirani iz 100 µM zaliha i pohranjuju se na - 20 stupnjeva. Prije upotrebe razrijedite na radnu koncentraciju (obično 0,1–1 µm). Predlošci poput genomske DNK trebaju biti alikvotirani u pojedinačnim - Koristite količine kako biste izbjegli unakrsnu kontaminaciju.
Savjeti za prevenciju kontaminacije: Osigurajte da su epruvete za centrifugu suhe prije nego što se alikvotiranje (zaostali etanol može inhibirati PCR), prije - hladne vrhove pipeta kako bi se spriječilo da se hladni reagensi zalijepe na zid i nose rukavice u cijelom procesu kako bi se izbjegla kontaminacija kože.
Iii. Označavanje i snimanje evidencije: Izbjegavajte zamku "crna kutija"
Jasno označavanje je ključno za PCR pakiranje; Netočno označavanje može pokvariti cijeli eksperiment.
Obvezne informacije o označavanju: naziv reagensa (npr. "2 × taq mastermix"), koncentracija/sadržaj (npr. 10 mm dntps "), serijski broj (za sljedivost), uvjeti skladištenja (npr. Stupanj zaštićen od svjetla"), datum alikvota i datum isteka u roku od 6 mjeseci ").
Posebno označavanje: Ako reagens sadrži glicerol (antifriz), boje (npr. SYBR GREEN) ili aditivi (npr. BSA), moraju se pružiti dodatne informacije (npr. "Sadrži 50% glicerola, ne pohranjuju na visokim temperaturama").
Zabilježite sinkronizaciju: Preporučuje se korištenje softvera za upravljanje proračunskom ili laboratorijom (npr. Labguru) za snimanje detaljnih parametara sadržaja svake cijevi (npr. Primer slijed, vrijednost TM) i povezati ih s fizičkim brojem oznake.
Iv. Skladištenje i transport: Temperatura uravnoteženja i fizička zaštita
Stabilnost PCR reagensa vrlo ovisi o uvjetima skladištenja, a tijekom transporta potrebna je dodatna zaštita.
Općenito pohranjivanje:
Enzimi (Taq, reverzna transkriptaza): dugački - termin pohranjivanje na - 20 stupnjeva (izbjegavajte opetovane cikluse zamrzavanja i odmrzavanja; alikvot i pohranite na -80 stupnjeva za buduću upotrebu);
Primeri/sonde: čuvajte na -20 stupnjeva više od jedne godine (ako sadrži modificiranu skupinu kao što je biotin, zaštititi od svjetla);
Non - enzimski međuspremnici (npr. PBS): Kratko - Izraz pohranjivanje na 4 stupnja (do 1 mjeseca).
Zahtjevi za prijevoz:
Za transport hladnog lanca koristite suhi led ({- 78 stupnjeva) za enzime (održavani ispod -20 stupnjeva) i plavi led (oko 0 stupnjeva) za pufere za kratkoročni prijevoz.
Izbjegavajte prekomjerne vibracije (PCR pločice treba osigurati u kutijama od pjene kako biste spriječili miješanje reagensa između jažica).
Tijekom visokih ljetnih temperatura dodajte izolacijski sloj pakiranju (npr., Aluminijska folija izolacijska vrećica + smrznuti gel pakiranje).
V. Uobičajeni problemi i rješenja
Problem 1: oborine reagensa (npr. DNTPS ili MGCL₂ oborine na niskim temperaturama) → Rješenje: Ukratko centrifuga (1000 o / min, 1 minutu) prije alikvotiranja. Otopite u inkubatoru od 37 stupnjeva prije upotrebe i vrtlog za temeljito miješanje.
Problem 2: Ploča za brtvljenje lako ispliva → Rješenje: Odaberite toplinu - otporni zabluda s ljepljivom podlogom ili upotrijebite toplinsko brtvilo (pogodno za visoke - eksperimente propusnosti).
Problem 3: Zamućene naljepnice → Rješenje: Upotrijebite vodootporni marker (kao što je Sharpie) ili laser - naljepnice za ispis kako biste spriječili da se rukopis izbriše alkoholom.
Zaključak
PCR pakiranje je više od samo "pakiranja" reagensa; To je prva linija obrane za eksperimentalnu pouzdanost. Odabirom odgovarajućih materijala, standardiziranjem postupka alikvotiranja, održavanjem temeljitog označavanja i održavanjem stroge kontrole temperature tijekom transporta, možete značajno smanjiti ljudsku pogrešku, osiguravajući stabilnije reakcije naknadnih pojačanja i pouzdanije rezultate. Zapamtite: Pojedinosti određuju uspjeh. Pravilne PCR prakse pakiranja mogu uštedjeti značajno rješavanje vremena tijekom cijelog vašeg eksperimenta!